La temporada 2000–01 de la Segunda División B de España de fútbol corresponde a la 24ª edición del campeonato y se disputó entre el 3 de septiembre de 2000 y el 13 de mayo de 2001 en su fase regular. Posteriormente se disputó la promoción de ascenso entre el 18 de mayo y el 24 de junio.
Sistema de competición
Participan ochenta clubes de toda la geografía española, encuadrados en cuatro grupos de veinte equipos según proximidad geográfica. Se enfrentan en cada grupo todos contra todos en dos ocasiones -una en campo propio y otra en campo contrario- durante un total de 38 jornadas. El orden de los encuentros se decide por sorteo antes de empezar la competición. La Real Federación Española de Fútbol es la responsable de designar a los árbitros de cada encuentro.
El ganador de un partido obtiene tres puntos, el perdedor no suma puntos, y en caso de un empate hay un punto para cada equipo. Al término del campeonato, el equipo que acumula más puntos en cada grupo se proclama campeón de Segunda División B y juega la promoción de ascenso; junto con los segundos, terceros y cuartos clasificados de cada grupo para ascender a Segunda División. Esta promoción tiene formato de liguilla con cuatro grupos en los que se emparejan equipos de distintos grupos y que hayan quedado en posiciones distintas.
Los cuatro últimos equipos clasificados de cada grupo descienden a Tercera División. Los decimosextos clasificados juegan la promoción por la permanencia que se disputa por eliminación directa a doble partido y los emparejamientos se determinan por sorteo. Los dos equipos derrotados se enfrentan en otra eliminatoria a doble partido en la que el perdedor pierde la categoría.
Equipos de la temporada 2000/01
| Datos de ascensos y descensos
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 Club Atlético de Madrid "B" y CD Toledo descienden de Segunda División A. También descienden el CP Mérida, pero desaparece por motivos económicos; y el CD Logroñés que es descendido a Tercera División por motivos económicos.
 Real Jaén CF, Real Murcia CF, Racing de Ferrol y Universidad LPGC CF ascienden a Segunda División A.
Águilas CF, Real Avilés Industrial, Club Bermeo, Real Betis "B", CP Cacereño, CF Figueruelas, Gimnástica Segoviana, CD Izarra, UD Lanzarote, Lorca CF, CD Móstoles, Ontinyent CF, Real Oviedo "B", Sevilla FC "B", Valencia CF "B", Real Valladolid CF "B" y Yeclano CF descienden a Tercera División. También pierde la categoría el CD Manchego que desaparece.
AD Alcorcón, Algeciras CF, Almería CF, Benidorm CD, CD Burriana, RC Deportivo de la Coruña "B", SD Eibar "B", RCD Espanyol "B", CD Linares, CE Mataró, Peña Sport FC, Polideportivo Ejido, Racing de Santander "B", Club Siero, CD Tropezón, AD Universidad de Oviedo y UD Vecindario ascienden a Segunda División B. También ascienden el CD San Fernando que ocupa la plaza del CD Manchego, el CD Don Benito que ocupa la plaza del CP Mérida y el UDC Chantrea que ocupa la plaza del CD Logroñés.
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Equipos de la temporada 2000/01
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| Datos de ascensos y descensos
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Club Atlético de Madrid "B" y CD Toledo descienden de Segunda División A. También descienden el CP Mérida, pero desaparece por motivos económicos; y el CD Logroñés que es descendido a Tercera División por motivos económicos.
Real Jaén CF, Real Murcia CF, Racing de Ferrol y Universidad LPGC CF ascienden a Segunda División A.
Águilas CF, Real Avilés Industrial, Club Bermeo, Real Betis "B", CP Cacereño, CF Figueruelas, Gimnástica Segoviana, CD Izarra, UD Lanzarote, Lorca CF, CD Móstoles, Ontinyent CF, Real Oviedo "B", Sevilla FC "B", Valencia CF "B", Real Valladolid CF "B" y Yeclano CF descienden a Tercera División. También pierde la categoría el CD Manchego que desaparece.
AD Alcorcón, Algeciras CF, Almería CF, Benidorm CD, CD Burriana, RC Deportivo de la Coruña "B", SD Eibar "B", RCD Espanyol "B", CD Linares, CE Mataró, Peña Sport FC, Polideportivo Ejido, Racing de Santander "B", Club Siero, CD Tropezón, AD Universidad de Oviedo y UD Vecindario ascienden a Segunda División B. También ascienden el CD San Fernando que ocupa la plaza del CD Manchego, el CD Don Benito que ocupa la plaza del CP Mérida y el UDC Chantrea que ocupa la plaza del CD Logroñés.
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